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天博最新下载地址:蛋白纯化常见问题(二)

那么下面天博最新下载地址为大家简单介绍一下蛋白纯化常见问题(二)。
Q:Superdex 75( 球蛋白分离范围 3 – 70 KDA), Superdex 200 (10 – 600 KDA) 和 Superose 6(5-5000 KDA),分离范围有重叠,如何选择?
A:一般使待分离样品的分子量位于线性分离范围中部。根据分子量 Marker 在三种柱子上的表现,三者常规推荐 :蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考虑使用 Superdex 75;40 – 400 kDa的样品考虑使用 Superdex 200;分离 400 kDa 以上样品时,建议选择 Superose 6 Increase。

Q:脱盐实验中的缓冲液如何选择?
A:如果我们用缓冲液 A 来平衡柱子,上样后,走外水的样品其实是跟着平衡时的缓冲液 A 出峰并溶解在其中的(而非*后赶样品用的洗脱缓冲液)。因此,希望样品溶解在缓冲液 A 中,就用缓冲液 A 来平衡柱子。缓冲液的选择,依据实验需求和填料本身耐受性,同时确保样品在该缓冲液中稳定存在。通常,使用 10-50 mM 磷酸钠缓冲液,至少含有 25 mM NaCl 用于避免离子作用的非特异性吸附,中性 pH 7.0 ~ 7.4。或挥发性缓冲液如 100 mM 乙酸铵或碳酸氢铵。

Q:纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白,怎么回事?
A:若目的 His 标签蛋白正常表达(使用抗 His 标签的抗体进行 WB 检测)且充分释放至上清中,确认蛋白是流穿还是未被洗脱:
若 His 标签蛋白流穿 :
样品或结合缓冲液的条件不合适,注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
His 标签蛋白与填料的结合较弱:降低上样流速或增加孵育时间 ;增加标签 His 的数量(常用 6 – 10 个)。
His 标签未充分暴露:在变性条件(4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍) 下进行纯化或测试;重新构建克。谋 His 标签的位置。
尝试其他的金属离子:如 锌离子,钴离子等。
若 His 标签蛋白未洗脱:
洗脱条件过于温和:增加咪唑浓度或降低洗脱 pH(注意:pH降至 4.0 以下时 Ni2+ 会发生脱落)。
目的蛋白与填料发生非特异性疏水或其他相互作用:在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂(如 2% Triton X-100)或提高 NaCl浓度。
目的蛋白在填料中发生了沉淀:减少上样量;使用咪唑线性梯度而不是步级洗脱以降低洗脱得到的蛋白浓度;使用去垢剂或改变 NaCl 浓度;在变性条件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍 )下洗脱。


以上就是天博最新下载地址为大家整理总结关于蛋白纯化常见问题(二)。
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